動脈硬化閉塞癥（arteriosclerosis obliterans，ASO）是周圍血 管難治性疾病，其發(fā)病機制與脂質滲入、內膜損傷、血栓形成 和平滑肌細胞增殖有關，其中血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖是ASO發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)。

材料

1. 動物及飼料

選用SPF級雄性日本純種大耳白兔，體質 量約2~2.5kg，由北京昌揚西山養(yǎng)殖場提供，動物合格證號： SCXK（京）2011-0010，適應性喂養(yǎng)1周后用于實驗。動物飼養(yǎng) 室溫控制在20~25℃，相對濕度控制在50%~70%，通風良好。 飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。

2. 藥物

當歸四逆湯提取液制備：當歸四逆湯由當歸9g， 桂枝9g，芍藥9g，細辛3g，甘草6g，通草6g，大棗5枚組成，各藥 均購于山西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，取上述諸藥經水煎、醇沉后 制成提取液, 每毫升含中藥生藥為0.58g，由山西中醫(yī)藥大學附 屬醫(yī)院藥劑科提供。

3. 試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國GIBCO 公司）；二乙烯四乙酸二鈉（EDTA）（美國SIGMA公司）；血管 緊張素Ⅱ（AngⅡ）（A9525，Sigma）；PVDF膜（IPVH00010， Millipore）；ERK1（ab9363，Abcam）；c-myc（ab11917，Abcam）； GAPDH（ab8245，Abcam）；HRP標記羊抗兔二抗（D110058， BBI）HRP標記驢抗鼠二抗（D110 085，BBI）；ECL底物液 （NCI5079，Thermo）；X光膠片（XBT-1，柯達）。

4. 儀器設備

倒 置 熒 光 相 差 顯 微 鏡（I X 7 2 型，日本 OLY M PUS）；CO2培養(yǎng)箱（QP-8 0型，博 科）；超凈工作臺 （JB-CJ-1500FX，浙江孚夏醫(yī)療科技有限公司）；低溫離心 機（5810R型，德國EPPENDORF Centrifuge）；電熱恒溫水箱 （HHW21.600，蘇州偉羅自動化烘箱科技有限公司）；電轉儀 （Bio-Rad）；水平搖床（TS-1，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限 公司）；PH計（LP115，德國Metter-Toledo GmbH公司）；電子天平 （CPA，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

方法

1. 藥物血清的制備

①隨機將雄性日本純種大耳白兔，分 為正常組，當歸四逆湯高、中、低劑量組，每組各5只。
②灌胃給 藥，按“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”計算，用 藥組低、中、高劑量以1、2、4倍于臨床等效劑量給藥，分別灌 胃當歸四逆湯提取液0.95、1.9、3.8mL·kg-1·d-1（3組均用0.9% 氯化鈉溶液定容為10mL），正常組每日灌胃0.9%氯化鈉溶液 10mL，1次/d，共喂養(yǎng)2周。
③兔耳中動脈采血，分離血清，56℃ 滅活30min，分裝后放置-20℃保存?zhèn)溆谩?br />
2. 兔血管平滑肌細胞培養(yǎng)

采用組織貼塊法：
①將動物 處死，在無菌操作下，取出兔胸主動脈；
②將動脈放入培養(yǎng)皿 中，剝離外膜結締組織，沖洗血管內殘血，縱行剖開血管，輕輕 刮去內膜，用DMEM培養(yǎng)液沖洗；
③用眼科鑷撕下中膜平滑肌， 剪成約1mm3 左右的組織塊，再用DMEM培養(yǎng)液沖洗3次；
④用吸 管將組織塊送入培養(yǎng)瓶內，將組織塊按每塊間距0.5cm左右密 度均勻擺在瓶底；
⑤翻轉培養(yǎng)瓶使瓶底朝上，瓶內加入DMEM 培養(yǎng)液（含20%胎牛血清），傾斜放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內 3～4h；
⑥待組織塊邊緣干固后，將培養(yǎng)瓶翻轉，使組織塊完全浸泡在培養(yǎng)液中，靜置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內4d；
⑦每4～5 天換1次培養(yǎng)液，待細胞長成致密單層時，以含0.1%胰蛋白酶 和0.1%EDTA的消化液消化傳代，傳代后用含10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)。第3～5代細胞用于實驗。

3. 細胞培養(yǎng)及處理

將生長良好的細胞用0.1%胰蛋白酶 和0.1%EDTA的消化液消化，用含10%胎牛血清DMEM配成單 個細胞懸液；以5×103 /孔的密度，接種于96孔板中，放置37℃、 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24h后，每組更換為含有5%正常組血清 的培養(yǎng)基；加入不同濃度的當歸四逆湯和同濃度血管緊張素 AngⅡ（1×10-8mol/L），并分為5組：正常組（正常兔血清）、模型 組（正常兔血清+AngⅡ）、高劑量組（當歸四逆湯高劑量血清+ AngⅡ）、中劑量組（當歸四逆湯中劑量血清+AngⅡ）、低劑量組 （當歸四逆湯低劑量血清+AngⅡ）；放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)72h；處理結束后收樣，保存于-80℃冰箱備用。

4. Western Blot法檢測

兔血管平滑肌細胞中ERK1、c-myc蛋 白的表達 電泳：各樣品取10μL總蛋白上樣電泳，根據蛋白分 子量配制15%的PAGE膠電泳。根據預染marker顯示，判斷目的 蛋白得到充分分離后，停止電泳。 轉膜（濕轉法）：取出凝膠用蒸餾水沖洗，PVDF膜用甲醇 浸泡數秒后和濾紙一同浸泡于電轉緩沖液中。按照黑色板-纖 維墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-纖維墊-白色板依次放好， 夾緊板后放入轉膜儀內。轉膜條件：ERK1，c-myc---100V， 60min。封閉：用含5%脫脂奶粉的TBST（封閉液）浸泡PVDF 膜，室溫搖床封閉1h。一抗：用封閉液稀釋相應的一抗，使 PVDF膜浸泡于一抗孵育6次，5min/次。二抗：使PVDF膜浸泡 于二抗孵育液中，室溫搖床孵育1h。顯色曝光：TBST充分洗滌 PVDF膜5~6次，5min/次。每張膜滴加適量的ECL底物液，孵育 數分鐘。X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影。

5. 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間資 料應用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結果 見圖1-圖4。結果顯示：與正常組比較，模型組ERK1、c-myc 蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各用藥組 ERK1、c-myc蛋白表達水平顯著降低（P<0.05，P<0.01）。其中， 高劑量組ERK1、c-myc蛋白表達水平降低最為明顯，低劑量組 變化差異最小。

討論

現代醫(yī)學認為，VSMC增生遷移是ASO發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)。 VSMC通過收縮和舒張調節(jié)血管張力，并通過分泌和釋放血管 調節(jié)因子維持血管的正常功能。正常情況下，血管內膜下層一 般不會有VSMC，然而在危險因素作用下，血管內皮結構和功能 受損，導致血管活性物質和細胞因子特別是生長因子的合成與 釋放，它們作用于VSMC膜受體，并激活細胞內信號傳導通路， 最終導致核內基因的表達而促進VSMC的過度增殖并向內膜遷 移，從而使血管內膜增厚，AS斑塊形成，甚至管腔狹窄，導致 ASO的發(fā)生。