激 素 性 股 骨 頭 缺 血 性 壞 死（steroid induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）是由 于糖皮質激素大量使用導致骨內循環障礙、骨代 謝失衡、破骨細胞增多而成骨細胞凋亡，破壞股 骨頭局部血運，引起缺血、壞死，繼而導致股骨 頭塌陷、骨折的一種骨疾病。近年來，由于糖皮 質激素在臨床治療中的濫用，SANFH的發病率日 漸增高，占非創傷性股骨頭壞死的首位，起病隱 襲，病情發展較快，致殘性強，已成為困擾醫患 的重大公共難題之一 。本院院內制劑川骨片對 SANFH有顯著臨床療效，但其機制尚不明確。分 裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一類絲氨酸/蘇氨酸 激酶，對細胞的生長、分化、炎癥反應等具有調節作用。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物

清潔級健康雄性日本大耳兔 56 只，體質量2.0～2.5 kg，由成都中醫藥大學實驗中 心提供（許可證號：川實動管第99011號），檢疫合格備用。本研究動物飼養及動物實驗均在成都中醫藥大學實驗中心完成，室內保持恒定溫度及濕 度，相對濕度為45%～60%。

1. 2 實驗藥物及制備

川骨片，由續斷、骨碎 補、黃芪、淫羊藿、肉蓯蓉、熟地、丹參、菟絲 子、枸杞、補骨脂、杜仲、當歸、牛膝、乳香、 沒藥、紅花、獨活、威靈仙、白術、茯苓、甘草 等組成，由成都中醫藥大學附屬醫院生產，批準 文號：川藥制字 Z20070657。仙靈骨葆膠囊（貴州 同濟堂制藥有限公司，批準文號：國藥準字 Z20025337），主要由淫羊藿、續斷、丹參、知 母、補骨脂、地黃等組成，研究已證明本品能抑 制破骨細胞的吸收活動，加快骨再建活動，刺激 骨形成，提高骨密度，是臨床上用于股骨頭壞死 治療的有效制劑，本實驗中作為陽性對照藥物進行 研究。將川骨片（規格：0.3 g/片）使用蒸餾水熬制 為水劑，制備為生藥量0.6 g/mL混懸液體。將仙靈 骨葆膠囊（規格：0.5 g/粒）用蒸餾水熬制為水劑， 制備為含成藥仙靈骨葆膠囊0.6 g/mL 的混懸藥液。 藥液均于0 ~ 4 ℃保存備用。以上藥液制備委托成 都中醫藥大學附屬醫院制藥車間完成。醋酸潑尼 松龍（華中藥業股份有限公司，規格：5 mL∶0.125 g， 生產批號：20171203）。

1. 3 主要試劑與儀器

p-ERK1/2、p-JNK 和 p-p38 抗體（美國 CST 公司）； GAPDH（武漢普健生物公司）。BCA蛋白定量檢測試劑盒、RIPA lysis buffer （上海碧云天公司）；十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰 胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒（武漢普健生物公 司）； 蛋 白 預 染 marker（美 國 Thermo Scientific公司）。TVO.63XC-MO HE染色成像系統 （廣州明美公司）；PP1152電泳儀（上海CAVOY 公 司）；EPS600C 電轉儀（上海天能公司）；TS-8S 脫色搖床（江蘇其林貝爾公司）；ChemiDocTM XRS+凝 膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；PerkinElmer全功 能微孔板檢測儀（美國PerkinElmer公司）。

1. 4 分組與造模

將56只雄性大耳兔隨機分成2 組，即空白組（16只）和造模組（40只）。適應性喂 養1周后，造模組采用賀西京造模法復制SANFH模 型：于兔右側臀部肌肉注射醋酸潑尼松龍8 mg/kg， 每周2次，連續注射6周。空白組右側臀肌注射等 量生理鹽水，每周2次，連續注射6周。所有動物 左側臀肌預防性注射青霉素8萬U/kg，預防感染， 每周2次，共6周。6周后處死空白組4只和模型組 4 只進行模型鑒定。在無菌條件下取出右側股骨 頭，采用蘇木素—伊紅（HE）染色，于光鏡下觀察 骨小梁、骨細胞、髓腔及造血細胞形態、結構和 數量的變化，并在股骨頭軟骨下區骨組織上隨機 選擇10個高倍視野，計算每個視野中所有骨陷窩 數和空骨陷窩數，計算出空骨陷窩率，判斷造模 是否成功。空骨陷窩率=空骨陷窩數/全部骨陷窩 數 × 100%。

1. 5 給藥方法

造模成功后剩余的36只造模組兔 再隨機分為模型對照組、川骨片治療組、仙靈骨 葆膠囊治療組，每組12只。按成人60 kg體質量換 算法換算，川骨片治療組給予川骨片（劑量為0.6 g·kg-1 ·d-1 ）灌胃，仙靈骨葆膠囊治療組給予仙靈骨 葆膠囊（劑量為0.6 g·kg-1 ·d-1 ）灌胃，模型對照組給 予蒸餾水1 mL/kg灌胃，空白組不做任何處理，連 續灌胃42 d。

1. 6 觀察指標與方法

1. 6. 1 取材

采用空氣栓塞法處死各組家兔，在 無菌條件下取出家兔右側股骨，取下股骨頭冠狀 面剖開分別置于 40 g/L 多聚甲醛、液氮中保存備 用。

1. 6. 2 光鏡觀察股骨頭組織形態

將組織放入配 好的混合酸脫鈣液中進行脫鈣，脫水機內依次梯 度酒精進行脫水，浸好蠟的組織于包埋機內進行包埋，石蠟切片機切片，片厚4 μm，HE染色，樹 膠封片供鏡檢。

1. 6. 3 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測股骨頭

組織 p-ERK1/2、p-JNK 和 p-p38 蛋白表達 將組 織剪碎，加入配制好的RIPA裂解液中，然后進行 離心等處理，用 BCA 試劑盒檢測總蛋白含量。 12%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離蛋白，電轉移至PVDF 膜上，一抗（pERK1/2 1∶2 000 稀釋，p- JNK 1∶1 000 稀釋，pp38 1∶1 000 稀釋，GAPDH 1∶5 000 稀釋）4 ℃過夜 孵育，室溫二抗孵育1 h，ECL化學發光試劑盒顯 影，洗片。膠片經掃描儀掃描后獲得圖像。用 Image J軟件計算目的蛋白條帶與內參GAPDH蛋白 條帶的灰度比值（p）。

1. 7 統計方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據 分析，計量資料以均數 ± 標準差（- x ± s）表示，組間 比較用單因素方差分析，股骨空骨陷窩率（p/%）組 間比較采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統計學 意義。

2 結果

2. 1 家兔股骨頭光鏡鏡檢結果

空白組：軟骨細 胞以及骨細胞基質紅染，染色均勻，軟骨細胞排 列規則整齊，組織結構清晰可見，潮線完整。股 骨頭部骨小梁完整無明顯變形、斷裂，排列規 則，骨組織內可見大量活躍的成骨細胞，骨陷窩 稀少，滋養血管豐富，髓腔內可見大量形態規則 的造血細胞，整個組織的結構完整，其中僅可見 極少的脂肪細胞。模型對照組：軟骨細胞破壞明 顯，細胞變形，不規則，整個軟骨層組織排列粗 糙不平整，可見較寬的細胞間隙直達深層組織， 部分動物可見股骨頭軟骨細胞完全剝離，軟骨組 織結構模糊不清，潮線明顯中斷。骨組織的骨小 梁變細，稀疏，排列不規則，結構紊亂，骨小梁 之間的間距增寬，骨髓內中可見大量分布的脂肪 細胞，而骨細胞則變形萎縮，在組織邊緣聚集， 組織內可見大量骨陷窩存在。川骨片治療組：鏡 下可見關節軟骨輕度變性，軟骨表面細胞排列不 規則，粗糙不整，軟骨下骨組織內可見較豐富的 血管分布，骨組織的四層結構基本清晰，潮線不 連續，鏡下可見少量炎性細胞增生，骨小梁較模 型對照組粗大，骨髓腔內可見造血細胞散在分布，大部分的骨細胞形態結構正常，骨組織內鏡 下可見的空骨陷窩較模型對照組有所減少。仙靈 骨葆膠囊治療組：鏡下可見關節軟骨輕度變性， 軟骨表面細胞排列不規則，粗糙不整，軟骨下骨 組織內可見較豐富的血管分布，骨組織的四層結構基本清晰，潮線不連續，鏡下可見少量炎性細 胞增生，骨小梁較模型對照組粗大，骨髓腔內可 見造血細胞散在分布，大部分的骨細胞形態結構 正常，骨組織內鏡下可見的空骨陷窩較模型對照 組有所減少。

2. 2 各組家兔股骨空骨陷窩率比較

造模組家兔股骨空骨陷窩率明顯高于空白組 （P＜0.05）。表明糖皮質類激素可以導致骨細胞的 破壞，導致空骨陷窩率明顯升高。提示實驗前期 造模成功。第 13 周時，與模型對 照組比較，川骨片治療組、仙靈骨葆膠囊治療組 的空骨陷窩率明顯較低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；川骨片治療組空骨陷窩率與仙靈骨葆膠囊 治療組比較，差異無統計學意義（P > 0.0.5）。

3 討論

目前，激素性股骨頭缺血性壞死（SANFH）的 發病機制仍不明確，存在高凝低纖溶微血管血栓 栓塞學說、脂肪代謝紊亂學說、骨內高壓學說、 二次碰撞學說、遺傳以及基因多態性學說等 。 但股骨頭缺血壞死的發病機制更多集中于分子生 物學水平細胞增殖、分化、凋亡的研究。MAPK通 路在促進細胞增殖、分化、抑制其凋亡中發揮重 要作用。ERK1/2、p38、JNK是MAPK家族的主要 成員。活化的 MAPK 通過級聯反應將外界信號傳 遞給細胞核，通過作用于 AIF-2、cMyc 等轉錄因 子，調節與細胞增殖、分化相關的基因表達。其 中最早發現的Ras-Raf-MAPK經典信號轉導途徑是 ERK1/2 信號通路，ERK1、ERK2、ERK3、ERK4 和ERK5是它的5個亞組，其中ERK1和ERK2是2 個高度同源的亞類，它們的分子質量分別是 44 kDa和42 kDa，它們在增殖過程中起著重要作用， 卻在分化過程中作用不明顯。Raf家族屬于促分 裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAPKKK），當Raf被 激活，其后使 MEK1/2 磷酸化，最終磷酸化激活 ERK1/2。被激活的ERK1/2轉位至核內，引起細胞 生長、增殖與分化。



 

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