藤茶［Ampelopsis grossedentata ( Hand． -Mazz． ) W． T． Wang］屬葡萄科蛇葡萄屬中的一種野生藤本 植物，主要分布于我國長江流域，始載于《茶經》，作 為民間日常飲用茶，其入藥記載初見于《草本便 方》: “藤茶葉甘溫消渴，諸氣鼓脹月活，丹停氣腫下 盅毒，利便通腸代茶喝”。研究表明藤茶具有殺 菌消炎、抗氧化、保肝、預防癌癥等作用，主要活 性成分為二氫楊梅素( dihydromyricetin，DMY) ，另含 有楊梅素( myricetin，MY) 等其他黃酮類化合物，其 莖葉 DMY 含量可達 30%，近年來研究報導 DMY 和 MY 具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗高血壓、預防動 脈粥樣硬化等藥理作用，是極具開發前景的天 然藥物成分。

1 材料和試劑

1． 1 儀器

HPLC 系統( 島津公司，日本) ，AB SCIEX 4000 Q TＲAP LC-MS /MS 系統和 Analyst software 1． 6． 1 工作站( AB SCIEX 公司，美國) ，VOＲTEX-5 旋渦振蕩器( 海門市其林貝爾儀器制造有限公司， 中國) ，低溫高速冷凍離心機( Sigma 公司，3-18K，德 國) ，超低溫冰箱( 三洋公司，日本) 。GH-202 電子 分析天平( AND，日本) 。

1． 2 試藥

二氫楊梅素衍生物的合成 3，5，7，3’，4’，5’-六乙酰基二氫楊梅素( 3，5，7，3’，4’，5’- hexaacetyl dihydromyricetin，DMY-1) 與 3，3’，4’，5’- 四乙酰基二氫楊梅素( 3，3’，4’，5’-tetraacetatyl dihydromyricetin，DMY-2) 合成方法詳細見課題組的前期研究，簡述如下: 藤茶經過提取、分離、純化 獲得 DMY 和 MY。一定量的 DMY 與乙酸酐和高氯 酸在室溫下發生反應獲得白色固體，將干燥的白色 固體進行重結晶，得到純度為 84． 3% 的 DMY-1。同 理，一定量 DMY 與乙酸酐和原硼酸發生反應，乙醇 重結晶，得到純度為 88． 2% 的 DMY-2。 二氫楊梅素對照品 ( 含 量: 98． 0% ，批 號 150507) ，楊 梅 素 對 照 品 ( 含 量: 98． 0% ，批 號 150311) ，異甘草素對照品( Isoliquiritigenin，ISL，含 量: 100． 0% ，批號 140928) 作為檢測內標( internal standard，IS) ，均購買于長沙昂諾生物科技有限公 司; 二氫楊梅素原料藥( 含量: 98． 0% ，湖南中醫藥 大學天然藥物化學實驗室自制) ，楊梅素原料藥( 含 量: 98． 0% ，湖南中醫藥大學天然藥物化學實驗室自 制) ; DMY-1、DMY-2 為湖南中醫藥大學天然藥物化 學實驗室自制，經 HPLC 歸一化法分析含量分別為 84． 3% 和88． 2% 。甲醇和乙腈( 色譜純，Merck，Germany) ，甲 酸 ( 色 譜 純，ＲOE scientific inc． ，USA， LOT0J0921) ，純凈水由實驗室的純水儀所制( ＲODI12AL，AQUA SOLUTIONS ，INC，美國) 。

1． 3 動物

24 只 SD 大鼠，質量 200 ～ 250 g，雌雄 各半，購于湖南省斯萊克景達實驗動物有限公司， 許可證號: SCXK( 湘) 2011-0003，飼養于中南大學湘 雅二醫院實驗動物房，實驗單位使用許可證編號: SYXK( 湘) 2012-003。

2 方法與結果

2． 1 色譜與質譜條件

色譜條件: 色譜柱為 Ultimate AQ-C18 ( 3． 0 mm × 100 mm，3． 0 μm) ，Welch Materials; 預柱: SecurityGuardTM Cartridges C18 ( 4 × 3． 0 mm) ，美國菲羅門公司; 流動相 A 為水相: 0． 1% 的 甲酸-水溶液，流動相 B 為有機相: 純乙腈，梯度洗脫 程序為 10% B( 0． 01 ～ 0． 30 min) ，10 ～ 70% B( 0． 30 ～ 1． 90 min) ，70% B( 1． 90 ～ 3． 50 min) ，70 ～ 10% B ( 3． 50 ～ 3． 70 min) ，10% B( 3． 70 ～ 6． 40 min) ; 流速: 0． 4 mL·min － 1 ( 0． 01 ～ 0． 40 min) ，0． 6 mL·min － 1 ( 0． 50 ～ 6． 10 min) ，0． 4 mL·min － 1 ( 6． 10 ～ 6． 40 min) ; 柱溫 45 ℃。

2． 2 標準溶液配置及標準曲線制備

DMY、MY 及 ISL( IS) 對照品分別用純甲醇溶解配置得到標準儲 備液為 800，620，480 μg·mL － 1，放置 － 20 ℃ 冰箱保 存。將空白血漿加入標準儲備液配成 DMY 的標準 曲線質量濃度為1． 0，2． 5，5． 0，10． 0，50． 0，200． 0， 800． 0 和 1 200． 0 ng·mL － 1，質控樣品質量濃度為 2． 0，60． 0，1 000． 0 ng·mL － 1，MY 的標準曲線質量濃度 為 1． 0，3． 0，6． 0，18． 0，30． 0，60． 0，120． 0 和 150． 0 ng·mL － 1，質控樣品濃度為 2． 5，50． 4，132． 0 ng· mL － 1，內標沉淀劑濃度為 14． 4 ng·mL － 1。所得結果 表明 DMY 在濃度為 1． 0 ～ 1 200． 0 ng·mL － 1、MY 在 1． 0 ～ 150． 0 ng·mL － 1 的血漿中的線性關系良好， DMY 和 MY 在血漿中的線性方程分別為: Y = 0． 016 7X + 0． 055 5( r = 0． 999 6) ，Y = 0． 019 8X + 0． 004 32 ( r = 0． 999 2) ，最低定量限均為 1． 0 ng·mL － 1，最低 定量限考察的 ＲSD 均小于 12． 0% 。

2． 3 樣品處理

將血漿樣品從 － 70 ℃ 冰箱取出室 溫下解凍，渦旋混合30 s，精密吸取30 μL 血漿置1． 5 mL EP 管內，加入 90 μL 內標沉淀劑( ISL 14． 4 ng ·mL － 1 ) ，渦旋振蕩 3 min 后，離心 10 min( 15 000 r· min － 1 ) ，取上清液 60 μL 與去離子水 60 μL 混合入 進樣瓶，進樣 5μL，以內標法定量分析。

3 討論

DMY、DMY-2、MY 在 ESI 源負離子采集模式下均能獲得較高的靈敏度和 高選擇性，但是 DMY-1 只能在 ESI 源正離子模式下 才能獲得質譜響應，見圖 1 所示。DMY、MY、DMY2、ISL 和 DMY-1 的質譜調諧后的離子對分別為 m / z 319． 0 →192． 9、m / z 317． 1 →179． 0、m / z 487． 3 → 403． 2、m / z 255． 0→118． 9 和 m / z 590． 4→489． 3。為 獲得最佳靈敏度和峰型，分別比較了甲醇、乙腈與 含不同比例的甲酸、醋酸銨水溶液對待測物進行色 譜分離，結果表明: 水相中只添加0． 1% 甲酸比含有 緩沖鹽更能改善色譜峰型。因此本研究最終在水 中加 0． 1% 甲酸作為水相來進行色譜分離。此外， 為了滿足同時分析檢測這 5 個化合物，采用梯度洗 脫能 夠 實 現 快 速 分 離，DMY、MY、DMY-2、IS 和 DMY-1 的保留時間分別是4． 00，4． 26，5． 00，4． 73 和 5． 30 min，總運行時間為 6． 4 min，相比于報道 的進樣時間，得到很大的改善，實現了快速分離。



 

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