我國是農業大國，伴隨著農產品生產加工，每 年產生大量農業廢棄物。 這些農業廢棄物資源再 生利用率極低，大部分被浪費。 大力開發利用這 些資源可以緩解環境、資源和糧食危機，因此農業 廢棄物再利用成為近十幾年各國研究的熱點。 木 聚糖是結構比較復雜的半纖維素， 為世界第二大 可再生資源。 由于木聚糖結構復雜，它的徹底水 解需要一系列酶的協同作用， 其中最關鍵的酶是 木聚糖酶。 在眾多應用中，以木聚糖經酶法制取 有較高附加值的功能低聚糖， 是富含半纖維素材 料的農業廢棄物再生利用的有效增值途徑， 具有 巨大的潛在經濟效益和環保意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

土壤樣品來自云南、貴州、河南、河北等 15 個 地區。 樣品采用鐵鏟采集，用刮刀除去 5 cm 厚的 表層土。 將采集的土壤樣品保存于無菌塑料袋中， 于-4 ℃冰箱保存待用。

1.2 主要試劑

DNA 瓊脂糖凝膠回收 試劑盒 （ 美 國 OMEGA）；瓊脂糖（西班牙 Biowest）；十六烷基三甲 基溴化銨（CTAB）、十二烷基磺酸鈉（SDS）購自上 海生工生物技術有限公司；RNA 酶， 蛋白酶 K 來 自 （日本 TAKARA）；Sau 3A I、BamH I、CIAP、T4 DNA 連 接 酶 、Q5 DNA 聚 合 酶 、λDNA/Hind III、 DL2000、1 kb Plus DNA Ladder，pUC19、E.coli DH5、pET28a 載 體 、E.coli BL21 （DE3）感 受 態 細 胞 （日本 TAKARA）； 氨芐霉素 （Amp） 蛋白 胨 （Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）（英國 Oxford 公司）；Gel Exraction Kit （美國 OMEGA）；剛 果 紅，卡 那 霉 素（美 國 AMRESCO）；櫸 木 木 聚 糖 （美國 Sigma）。

1.3 主要設備與儀器

DYC P-31BN 水 平 電 泳 槽 、DYY-10C 電 泳 儀， 北京六一儀器廠；Image Quant 300 凝膠成像儀、Multitemp III 恒溫循環水浴器， 美國 GE 公 司；Sigma 1-14 小型臺式高速離心機，美國 Sigma 公司；WD-9405B 型水平搖床，北京六一；PCR 儀， Biometra，德國；ImageQuant 300 凝膠成像儀，Multitemp III 恒溫循環水浴器，美國 GE；瓊脂糖凝膠 電泳儀，北京六一；DHZ-DA 全溫振蕩器，江蘇太 倉培英；萬向搖床TS-92型,海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Nanodrop 核酸定量儀，Thermo 公司。

1.4 土壤宏基因組文庫構建

每次稱取 80 g 土壤， 用提取緩沖液 （TrisHCl：100 mmol/L pH 8.0； EDTA：100 mmol/L， pH 8.0；NaCl：1.5 mol/L；CTAB：1%） 溶 解 稀 釋 土 樣 ， 225 r/min。 混勻 2～3 h。 具體提取方法參照 Zhou 等 1。 將回收后的 DNA 片段采用 Sau3A I 進行部分 酶切，并與經 BamH I 酶切后與 pUC19 載體進行 連接，電轉化法導入到 DH5α 中。

1.5 土壤宏基因組文庫的篩選

土壤宏基因組文庫的篩選方法參照 Kwon 等， 將文庫中的克隆子轉接到含有 0.5%的木聚 糖底物的平板上培養 24 h，將平板放置在 50 ℃烘 箱 30 min 后，剛果紅染色 15 min， 1 mol/L 的 NaCl 脫色 15 min， 在底物平板上能產生透明圈的克 隆即為陽性克隆。

1.6 木聚糖酶基因

cbxynA 序列分析 對上述篩選得到的陽性克隆子提取質粒并測 序， 用在線軟件預測外源插入片段所有可能的開 放閱讀框，用 DNAMAN 預測目的基因可能的分子 質量和等電點。

1.7 重組酶

CBXYNA 的表達和純化 利用 Primer5 軟件設計引物， 擴增 cbxynA 的 ORF 編 碼 序 列 。 在 序 列 N 端 正 （5’ -CATGCCATGGCACACGTACACGTCCCG-3’） 引入 Xho I 位 點 ， 在 C 端 （5’ -CCGCTGAGGCAGGCTGCGAAAAGCCC-3’）引入 Nco I 位點。 將目的基因 cbxynA 經 Xho I 和 Nco I 雙 酶 切 后 連 接 到 pET-28a （+） 載 體 并 轉 化 到 BL21 （DE3）感受態細胞中進行異源表達。 對表達過程 中何時加入 IPTG 的誘導時機、加入 IPTG 誘導后 的溫度、 誘導的時間及 IPTG 濃度等參數進行優 化。 收集菌體后用裂解液裂解，超聲波破碎細胞后 離心收集上清粗酶液。 用 Ni 柱純化粗酶液，先用2.5% wash&elution buffer 對柱料進行沖洗， 通過 A280 檢測器對除雜蛋白情況進行監控，直至檢測 器顯示沒有雜峰的出現。 用 wash & elution buffer 對柱料進行梯度洗脫 ， 梯 度 分 別 為 5% ，10% ， 20%，40%，60%，80%，100%。并將對應的出峰時間 的蛋白進行收集。 用 SDS-PAGE 電泳檢測純化后 的酶蛋白。

1.8 重組酶

CBXYNA 活力及酶學性質測定 以木聚糖為底物， 采用 DNS 法測定酶活力。 酶最適 pH 值和 pH 穩定性測定緩沖液體系為 pH 值 2.2～11。每種緩沖體系 5 個點，共 35 個點。重組 CBXYNA 酶活力的測定在 50 ℃下進行，將常規方 法中的緩沖液替換為上述不同 pH 體 系 的 緩 沖 液，測定所得酶活力記為 100%。 pH 穩定性是將酶 液稀釋，使酶液處于不同的緩沖體系中，50 ℃下保 溫 30 min 后立即冰浴終止反應，之后按照 DNS 測 定方法測定殘余酶活力， 以未經保溫處理的重組 木聚糖酶 CBXYNA 活力為 100%， 分別計算不同 pH 下的殘余相對酶活力。 測定最適溫度時， 用最適 pH 緩沖液將酶稀 釋一定比例，然后置于 40～80 ℃的不同溫度下，反 應 10 min，測定酶活力，以最大值為 100%。溫度穩 定性的測定， 將樣品與酶最適反應緩沖溶液以一 定比例混勻，置于不同溫度（50，55，60，65，70 ℃） 中保溫不同時間 （0，30 min，1 h，1.5 h，2 h，3 h，4 h，5 h）。 定時取樣，測定樣品殘留酶活力，以未處 理木聚糖酶活力作對照。 考察的金屬離子 Na+ 、K+ 、Li+ 、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Fe3+、Al3+、Cu2+對 CBXYNA 酶活力的影響。 酶 對底物特異性的研究，添加 1%（w/v）的燕麥木聚 糖、樺木木聚糖、水溶性玉米芯木聚糖、水不溶性 玉米芯木聚糖在 0.05 mol/L，pH 5.2 的 醋 酸 緩 沖 液中，反應時間為 10 min，反應溫度為 55 ℃條件 下測定木聚糖酶活力。

2 結果與分析

從土壤中提取總的 DNA，經純化濃縮后的 23 kb 以上的 DNA 的量約為 6 μg。 因土壤環境中得 到的總 DNA 片段較長，不利于外源片段插入載體 中。 故采用 Sau3A I 酶對回收的土壤 DNA 片段 進行部分酶切， 再用 1%的瓊脂糖凝膠回收 2～10 kb 以內的 DNA 片段約 2 μg 左右。將酶切時間設置為 1 h， 每 100 μL 加入 0.75 U 的 Sau3A I 酶，使得土壤 DNA 的條帶分布在 2～ 8 kb，符合構建質粒土壤宏基因組文庫。 酶切之后 的土壤 DNA 與 pUC19 載體經 T4 連接酶連接后， 導入到 DH5α 中。 將轉化產物涂布平板后獲得了 大量宏基因文庫克隆子。 從文庫中隨機提取 10 個 克隆子并提取質粒，用 EcoR I 和 Hind III 雙酶切 之后，結果表明：質粒間插入的外源酶切帶型差異 顯著，文庫克隆片段隨機性較高。 外源插入大小為 1.5～4.5 kb，平均為 3 kb，粗略計算，宏基因組的庫 容量為 30 Mb。將篩選得到的陽性克隆子 Cb5545 測序，得到 一段 4 238 bp 的 DNA 序列，并預測了該外源插入 片段的所有可能開放閱讀框， 其中開放閱讀框 ORF10 是一個 822 bp 長的編碼木聚糖酶的完整 的開放閱讀框， 其編碼產物的氨基酸序列與來自 Halobacteriaceae archaeon（古細菌屬）編碼的木聚 糖酶的相似度最高也僅為 45%， 表明該序列是一 條未知的新序列 （GenBank 登記號：KY062986）。 該基因編碼的產物由 273 個氨基酸組成， 預測的 分子質量為 29.1 ku，等電點為 5.2。將目的基因 cbxynA 克隆到 pET-28a（+）表達 系統里進行異源表達。 對重組質粒何時加入 IPTG 誘導的時機、加入 IPTG 后的誘導時間、誘導溫度 及 IPTG 濃度進行優化。 最終的優化結果如圖 4 所 示。 結果表明：培養 5 h 后，添加 IPTG 終濃度為 0.7 mmol/L，在 23 ℃下誘導 25 h，獲得的最大酶活 力為 52 U/mL，較初始值提高了 4.3 倍。

3 結論

研究從土壤宏基因文庫中篩選并鑒定出一個 木聚糖酶基因 cbxynA，經分析表明該基因是一段 未知的新序列。 隨后對該基因進行克隆表達，對其 原核表達條件進行了優化， 最終獲得其最大酶活 力為 52 U/mL，較初始值提高了 4.3 倍。 重組木聚糖 酶 CBXYNA， 其 最 適 pH 為 5.2，pH 在 4.2 到 10.2 之間時其酶活力在 70%以上， 有較好的 pH 穩定性。 CBXYNA 的最適溫度為 55 ℃，在 50～60 ℃保溫 30 min 酶活力仍在 80%以上， 具較好的熱 穩定性。 Na+ 、K+ 、Ca2+、Li+ 在 1～7 mmol/L 的范圍之 內對酶有促進作用，Mn2+、Zn2+、Fe3+、Al3+、Cu2+對酶有抑制作用， 且抑制作用隨著金屬離子濃度的升 高而增強。其中，Cu2+對酶的抑制作用最明顯，幾乎 使其完全喪失酶活。 當該酶以水溶性玉米芯木聚 糖、燕麥木聚糖、水不溶性玉米芯木聚糖、酶活力 分別為 162%，139%，74%， 說明該 CBXYNA 更容 易結合水解水溶性木聚糖底物。 重 組 木 聚 糖 酶 CBXYNA 有較好的 pH 穩定性， 可用于造紙、飼 料、食品等工業應用中。 同時該酶以燕麥木聚糖、 水溶性玉米芯木聚糖為底物時，酶活力相對較高， 有較強的親和能力， 可被用于水解可溶性木聚糖 底物制備低聚木糖。